衆所周知，晚期胃癌和結直腸癌會引發嚴重的腹腔積液，并常常導緻惡性腹水（MA）的出現(xiàn)。在臨床上(shàng)對于惡性腹水的主要治療方法是針對惡性腫瘤細胞的治療，例如(rú)化(huà)療和靶向治療。雖然當前治療手段在不斷的進步，但(dàn)是仍然存在各種缺點和限制。首先，治療不能(néng)完全停止腹水的産生(shēng)，因為(wèi)腹水是由腹膜血管的生(shēng)成和血管滲透性介導增強産生(shēng)的，主要是由腫瘤細胞對藥物的原發性和繼發性抗性引起的。第二，狀況不佳的患者，尤其是老年患者，既不适合化(huà)療也(yě)不适合手術，而隻能(néng)接受姑息性容量以減輕壓迫症狀，包括通過穿刺引流腹水，也(yě)就(jiù)是腹膜分(fēn)流術。然而這(zhè)種方法往往會導緻蛋白質流失，電解質紊亂，甚至危及生(shēng)命的感染。
OH2病毒是一(yī)種ICP34.5和ICP47基因缺失，并表達人(rén)GM-CSF的單純溶瘤疱疹病毒。ICP47基因的缺失導緻US11基因處于ICP47早期啓動子(zǐ)的控制之下(xià)，而不是處于導緻腫瘤選擇性複制增強的US11晚期啓動子(zǐ)的控制。ICP34.5編碼序列替換為(wèi)由巨噬細胞啓動子(zǐ)、編碼人(rén)類GM-CSF的基因和牛生(shēng)長激素pA序列組成的序列盒。
1.OH2在體(tǐ)外和體(tǐ)内的溶瘤能(néng)力
在文中作(zuò)者構建了(le)CT26小鼠腫瘤模型，分(fēn)别向腫瘤内注射3種不同劑量的OH2(1E6、1E5、1E4CCID50)，觀測OH2在體(tǐ)内從第一(yī)次給藥到第21天後抑制腫瘤生(shēng)長的情況。(A)治療方案的模式；(B,C)E4組第21天的腫瘤體(tǐ)積和生(shēng)長曲線；(D,E)E5組第21天的腫瘤體(tǐ)積和生(shēng)長曲線；(F,G)E6組第21天的腫瘤體(tǐ)積和生(shēng)長曲線。以上(shàng)結果表明OH2能(néng)夠有效地抑制腫瘤的生(shēng)長，其中E6和E5可能(néng)是腹水研究的合适劑量。
2.OH2抑制小鼠腹水生(shēng)成
OH2抑制腹水生(shēng)成，延長存活時(shí)間(jiān)。(A)治療方案的模式；(B)在第一(yī)次治療後的第9天，OH2抑制了(le)小鼠腹水重量中的腹水生(shēng)成；(C)不同組中總存活時(shí)間(jiān)的曲線。
3. 腹水中OH2感染後的細胞因子(zǐ)水平
(A)自第一(yī)次治療後第4天腹水的細胞因子(zǐ)水平；(B)自第一(yī)次治療後第9天腹水的細胞因子(zǐ)水平；(C)自第一(yī)次治療後第4天血清中的細胞因子(zǐ)水平；(D)第一(yī)次治療後第9天血清中的細胞因子(zǐ)水平。
作(zuò)者發現(xiàn)，OH2組小鼠在接受治療後第4天，檢測後發現(xiàn)其腹水中多種細胞因子(zǐ)水平（尤其是IL-6和IFN-γ）比對照組高（超過四倍）,TNF和IFN-γ的水平也(yě)呈上(shàng)升趨勢（圖3）。在實驗結束時(shí)（第9天），仍有腹水的小鼠體(tǐ)内的細胞因子(zǐ)雖然略高于對照組，但(dàn)是與之前相比顯著下(xià)降。小鼠外周血細胞因子(zǐ)水平與腹水相比基本正常。結果表明，OH2可能(néng)是通過其直接的溶瘤細胞毒性作(zuò)用促進炎症的發生(shēng)從而導緻細胞死亡，其特征是促炎細胞因子(zǐ)（主要是IL-6）的快(kuài)速大量分(fēn)泌。因此，是否存在區域細胞因子(zǐ)風(fēng)暴以及如(rú)何激活免疫系統并協同發揮抗腫瘤作(zuò)用是作(zuò)者進一(yī)步研究的目的。
4. OH2激活腹水中的CD8+T和CD4+T細胞
通過流式細胞儀分(fēn)析，在第4天和第9天，OH2增加了(le)小鼠腹水中CD4+和CD8+T細胞的數量。(A)對照組腹水中CD8+和CD4+T細胞；(B)OH2治療腹水中的CD8+和CD4+T細胞；(C)第4天小鼠腹水中CD4+和CD8+T細胞的百分(fēn)比；(D)第9天小鼠腹水中CD4+和CD8+T細胞的百分(fēn)比，結果表明OH2可以促進各種淋巴細胞的增殖從而改變腹水的免疫微環境。
5. 通過scRNA-seq進行的T細胞亞群和功能(néng)分(fēn)析
作(zuò)者将T細胞分(fēn)成不同的免疫群體(tǐ)組(圖5)，通過對每個(gè)群體(tǐ)的标記基因表達進行scRNA測序。作(zuò)者發現(xiàn)在這(zhè)六組細胞中(圖5C)，T細胞、單核細胞、巨噬細胞、B細胞、NK細胞和中性粒細胞的比例随着OH2感染而急劇(jù)變化(huà)。
對上(shàng)調的T細胞中進一(yī)步分(fēn)析顯示，CD4+和CD8+T細胞數量都顯著增加，其中CD4+的影響更強(圖5E，F)。大量中性粒細胞的激活可能(néng)與細胞因子(zǐ)的釋放(fàng)有關(guān)，是導緻局部細胞因子(zǐ)風(fēng)暴的原因之一(yī)。
此外，注射OH2以後，NK細胞的比例随着IFN-γ的上(shàng)調而輕度增加，IFN-γ是一(yī)種代表免疫刺激活性的細胞因子(zǐ)（圖5C）。值得注意的是，免疫抑制性Treg細胞在OH2處理(lǐ)的腹水中也(yě)富集，這(zhè)表明OH2對免疫微環境的調節不是直接的陰陽二元效應，而是交互影響。
同時(shí)，免疫抑制相關(guān)基因的表達水平随着T細胞比例的增加而升高。例如(rú)，作(zuò)者在T細胞和嗜中性粒細胞的OH2治療組中發現(xiàn)免疫檢查點基因的上(shàng)調，如(rú)Cd274(編碼PD-L1)和Pdcd1(編碼PD1)(圖5F，H)。
6. 通過tocilizumab阻斷IL-6信号通路(lù)下(xià)調OH2活性以消退腹水
通過tocilizumab(托珠單抗，IL-6受體(tǐ)抑制劑)阻斷IL-6信号通路(lù)從而下(xià)調OH2活性。作(zuò)者通過同步托珠單抗暴露在模型動物中顯著消除了(le)由OH2引起的延遲腹水生(shēng)長的效果（圖6），并且未能(néng)延長存活期，這(zhè)與具有未受損IL-6信号傳導的小鼠模型不同。
然而，當IL-6信号傳導在病毒給藥96小時(shí)後受到托珠單抗藥理(lǐ)抑制作(zuò)用時(shí)，腹水阻塞的OH2效應無法抵消，最終啓動了(le)有效的抗癌免疫。作(zuò)者分(fēn)析了(le)六種細胞因子(zǐ)的水平，發現(xiàn)IL-6失活也(yě)可能(néng)導緻TNF-α的強烈下(xià)調和IFN-γ的釋放(fàng)。值得注意的是，OH2在IL-6信号傳導抑制後也(yě)不足以增加CD4+T細胞和CD8+T細胞的數量，這(zhè)再次表明炎症風(fēng)暴是免疫激活的主要原因。
7. 結果與討(tǎo)論
OH2能(néng)夠通過腹膜内注射消除腹水并顯著延長攜帶CT26腫瘤細胞的小鼠的存活，即使局部細胞因子(zǐ)風(fēng)暴也(yě)不會對主要器(qì)官造成明顯的全身(shēn)性損傷。與用5-氟尿嘧啶或無應答(dá)者治療的小鼠相比，在用OH2治療的腹水小鼠中觀察到促炎細胞因子(zǐ)(主要是IL-6)的高分(fēn)泌，以及CD4+和CD8+T細胞浸潤的增加。此外，IL-6途徑的初始階段阻斷能(néng)夠顯著抑制由OH2驅動的抗腫瘤免疫反應。
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