根據以往研究發現(xiàn)溶瘤病毒(OVs)能(néng)夠對腫瘤微環境(TME)有一(yī)定的激活作(zuò)用，并引起浸潤性腫瘤特異性T細胞的免疫反應。然而，OVs治療對腫瘤中的腫瘤免疫檢查點起了(le)負面影響，減弱了(le)抗腫瘤免疫反應。因此，開發新(xīn)的策略來(lái)最大限度地發揮OVs的潛力迫在眉睫。溶瘤病毒 (OVs) 在癌症治療中有出色的臨床療效，然而，僅有幾種癌症類型得到改善[1]。
首先，OVs 的内部傳播受到腫瘤異質性和宿主抗病毒免疫反應的限制，而病毒在腫瘤内的有效複制和傳播需要更強大的 OVs。其次，腫瘤微環境 (TME) 通常包含免疫抑制因子(zǐ)，要逆轉這(zhè)種負面的癌症免疫設定點，需要更合适的免疫調節劑的組合來(lái)進行治療[2]。PD-1是淋巴細胞上(shàng)的一(yī)種抑制受體(tǐ)，腫瘤通過抑制性配體(tǐ)程序性死亡配體(tǐ)1(PD-L1)逃避T細胞反應[3]。
作(zuò)者前期研究表明，癌細胞上(shàng)的配體(tǐ)PD-L1在溶瘤病毒治療的腫瘤内被上(shàng)調。除了(le)PD-1外，TME中還有多種其他的免疫抑制通路(lù)參與。免疫檢查點分(fēn)子(zǐ)，如(rú)細胞毒性T淋巴細胞抗原4(CTLA-4)、T細胞免疫球蛋白和粘蛋白結構域蛋白3(TIM-3)等經常在腫瘤浸潤淋巴細胞(TILs)上(shàng)過表達，導緻活化(huà)的CD8+T細胞耗竭[4]。因此，OVs聯合免疫檢查點抑制劑可以進一(yī)步增強TME中的T細胞效應功能(néng)，改善抗腫瘤免疫反應，成為(wèi)一(yī)種很有前景的免疫治療策略[5]。本文作(zuò)者通過将一(yī)個(gè)人(rén)源化(huà)的hPD-1阻斷劑基因(hPD-1)插入到親本OVH基因組中，構建了(le)一(yī)種溶瘤性單純疱疹病毒1型(HSV-1)病毒YST-OVH。
首先，作(zuò)者評估了(le)OVH的抗腫瘤療效。作(zuò)者使用了(le)C57BL/6鼠，皮下(xià)注射 Hepa1-6（5×106）腫瘤細胞，腫瘤達到250mm3時(shí)瘤内注射OVH（107 PFU）進行治療。OVH治療通過增強T細胞的募集顯著抑制了(le)腫瘤的生(shēng)長，但(dàn)它同時(shí)增加了(le)PD-1的表達，從而阻礙了(le)細胞毒性T細胞的抗癌作(zuò)用，并不能(néng)達到完全根除腫瘤的效果（圖1A-C）。因此，作(zuò)者結合OVH病毒治療和抗PD-1免疫治療來(lái)彌補它們各自的弱點。在Hepa1-6腫瘤模型中，抗PD-1抗體(tǐ)（200μg）和OVH的聯合使用不僅根除了(le)病毒注射的腫瘤，而且還根除了(le)遠(yuǎn)處腫瘤，且無複發(圖1D-G)。作(zuò)者還分(fēn)析了(le)參與聯合治療的關(guān)鍵免疫細胞，發現(xiàn) CD8+ T 細胞在對聯合治療的反應中起主要作(zuò)用，并且可能(néng)需要巨噬細胞和NK細胞的參與（圖1H-1K）。這(zhè)些(xiē)結果表明，聯合 OVH 和抗 PD-1抗體(tǐ) 療法可以克服免疫抑制性 TME 對免疫療法的耐藥，從而增強抗癌作(zuò)用。
PD-1的阻斷加上(shàng)病毒聯合療法具有治療癌症的潛力，因此，當前的首要任務(wù)是構建一(yī)個(gè)能(néng)識别hPD-1的人(rén)源化(huà)抗體(tǐ)的OV，從而進一(yī)步進行臨床研究。作(zuò)者通過篩選和構建，獲得了(le)一(yī)種人(rén)源化(huà)單克隆抗體(tǐ)hu17D5（抗PD-1抗體(tǐ)），并基于hu17D5的基因序列，構建了(le)hPD-1scFv，其結合活性高于市(shì)售的抗PD-1抗體(tǐ)派姆單抗(PEM)和尼魯單抗(NIV)(圖2A-F)。随後，作(zuò)者構建了(le)一(yī)個(gè)新(xīn)的OV，序列中含有hPD-1scFV基因的OV被命名為(wèi)YST-OVH(圖2G)。檢測YST-OVH感染的細胞上(shàng)清中hPD-1scFv蛋白的表達時(shí)間(jiān)依賴性上(shàng)升，72h到達峰值。該病毒與親本病毒在癌細胞中的複制效率相似；并能(néng)提高對T細胞激活活性以及恢複淋巴細胞的功能(néng)(圖2H-L)。值得一(yī)提的是，通過構建的人(rén)源化(huà)(PD-1-hu)轉基因小鼠可以很好(hǎo)(hǎo)地評估OV和hPD-1scFv誘導的抗腫瘤免疫反應，因為(wèi)hPD-1scFv蛋白不能(néng)與mPD-1結合，因此在常規小鼠中沒有活性。在PD-1-HU小鼠建立的Pepa-1-6腫瘤攜帶模型中驗證了(le)hPD-1scFv有良好(hǎo)(hǎo)的抗腫瘤效果(圖2M)。
随後作(zuò)者比較了(le)YST-OVH和OVH誘導的溶瘤作(zuò)用，其對多種腫瘤細胞具有殺傷作(zuò)用，且感染劑量與腫瘤細胞殺傷能(néng)力呈正相關(guān)(圖3A-B)。為(wèi)了(le)進一(yī)步評估YST-OVH在體(tǐ)内的腫瘤細胞殺傷能(néng)力，作(zuò)者在Hep3B和A549的皮下(xià)移植模型小鼠中進行評估，結果觀察到類似的腫瘤抑制作(zuò)用(圖3C-F)。然後，作(zuò)者又建立了(le)小鼠Hepa1-6癌細胞的雙側腫瘤模型。給藥後能(néng)夠使兩側腫瘤完全消退，且OVH治療小鼠和YST-OVH治療小鼠之間(jiān)沒有明顯的療效差異(圖3G-J)。以上(shàng)這(zhè)些(xiē)結果表明 YST-OVH在多種類型的腫瘤中複制，并且顯示出良好(hǎo)(hǎo)的溶瘤作(zuò)用。
作(zuò)者通過将表達螢火(huǒ)蟲熒光素酶基因的Hepa1-6細胞肝内注射到PD-1-HU小鼠體(tǐ)内，建立原位腫瘤模型，并比較靜脈注射YST-OVH與OVH的效果。與其他兩組相比， YST-OVH 治療組顯著抑制了(le)小鼠腫瘤生(shēng)長并增加了(le)總生(shēng)存時(shí)間(jiān)（圖 4A-D）。随後作(zuò)者通過皮下(xià)注射Hepa1-6 細胞建立了(le)PD-1-HU 小鼠的雙側腫瘤模型，以比較 YST-OVH 與 OVH在瘤内注射的藥效。結果發現(xiàn)，YST-OVH治療組比OVH治療組的小鼠腫瘤消退作(zuò)用更強，且對遠(yuǎn)側的腫瘤也(yě)有更好(hǎo)(hǎo)的效果。流式分(fēn)析結果顯示，注射YST-OVH顯著誘導IFN-γ+CD8+T細胞、IFN-γ+T-NF-α+CD8+ T細胞和GZMB+CD8+ T細胞的活化(huà)。以上(shàng)結果表明 YST-OVH 可以通過激活腫瘤浸潤性 CD8+ T 細胞來(lái)增強抗腫瘤功效(圖4H-I)。
接下(xià)來(lái)，作(zuò)者通過使用CyTOF分(fēn)析 TME中的精确動力學來(lái)确定YST-OVH在抗腫瘤中發揮的免疫相關(guān)的作(zuò)用。我們重點分(fēn)析了(le)T細胞亞群，當單個(gè)Marker在t-SNE圖中突出顯示時(shí)，指示T細胞的活化(huà)、分(fēn)化(huà)以及耗竭的關(guān)鍵标記定位在同一(yī)位置（圖5A）。PhenoGraphy對T細胞亞群的再分(fēn)析，确定了(le)10個(gè)主要的T細胞細分(fēn)亞群：CD8+T細胞（T3、T4、T5、T6、T8、T9和T11）、CD4+T細胞（T2和T7）、Treg細胞（T1）和其他CD3+細胞（T10）（圖5B）。
對這(zhè)些(xiē)T細胞簇的分(fēn)析顯示， OVH或YST-OVH治療後，TME中的T細胞群發生(shēng)顯著變化(huà)（圖5C）。在熱圖中顯示了(le)每個(gè)T細胞簇上(shàng)24個(gè)不同标記的表達譜（圖5D）。圖5E顯示了(le)每個(gè)T細胞簇在整個(gè)腫瘤浸潤T細胞群中的比例。值得注意的是，OVH治療和YST-OVH治療都導緻了(le)T細胞群體(tǐ)的顯著變化(huà)，其中YST-OVH顯著增加了(le)殺傷性T細胞中T6和T8比例，而耗竭性T細胞中T3,T5以及T11在對照組中普遍存在，OVH治療後顯著降低(dī)，而YST-OVH則降低(dī)得更為(wèi)明顯，特别是T3和T11。更為(wèi)重要的是，YST-OVH組中殺傷性T細胞高表達記憶性CD8+T細胞的Marker基因Ly6C，後來(lái)實驗也(yě)證明瘤内注射溶瘤病毒能(néng)夠誘導産生(shēng)腫瘤特異性以及病毒特異性的記憶T細胞。
有趣的是YST-OVH能(néng)夠誘導産生(shēng)很強的腫瘤特異性記憶T細胞，而産生(shēng)很弱的病毒記憶性T細胞，說(shuō)明YST-OVH能(néng)夠比OVH或對照組更早地影響CD8+T細胞，而且可能(néng)是通過重編程效應CD8+T細胞為(wèi)記憶性T細胞，從而改變整個(gè)瘤内TME環境此外，在所有耗竭性CD8細胞群中，抑制性受體(tǐ)基因CTLA-4和TIM3都有高表達，然而OVH或YST-OVH對T7細胞群都沒有明顯的作(zuò)用，說(shuō)明也(yě)許通過适當的免疫檢查點阻斷(如(rú)抗CTLA-4或抗TIM-3治療)來(lái)逆轉T細胞衰竭和阻斷活化(huà)的Treg細胞，可能(néng)能(néng)夠進一(yī)步促進YST-OVH治療的抗腫瘤作(zuò)用。
為(wèi)了(le)探討(tǎo)聯合抗CTLA-4是否能(néng)增強YST-OVH的抗腫瘤療效，作(zuò)者在此通過動物實驗進行驗證。如(rú)圖6B、C所示，YST-OVH，抗CTLA-4單藥治療均顯著抑制兩側腫瘤的生(shēng)長。此外，YST-OVH和抗CTLA-4聯合治療進一(yī)步減少了(le)兩側腫瘤的體(tǐ)積，4隻小鼠的注射側腫瘤獲得了(le)完全緩解，6隻小鼠的遠(yuǎn)側腫瘤完全緩解（圖6D-E）。随後比較了(le)YST-OVH和抗TIM-3的抗腫瘤作(zuò)用，均顯著抑制腫瘤的生(shēng)長(圖5F)。這(zhè)些(xiē)結果表明，抗CTLA-4或抗TIM-3聯合治療進一(yī)步提高了(le)YST-OVH的抗腫瘤療效。通過獲取治療小鼠的腫瘤，對RNA測序數據的分(fēn)析顯示，一(yī)些(xiē)免疫相關(guān)的信号通路(lù)，在共同治療的腫瘤中顯著富集。這(zhè)些(xiē)結果表明，YST-OVH和抗CTLA-4聯合應用可通過提高腫瘤的免疫原性，進一(yī)步提高抗腫瘤療效。
圖 7 YST-OVH 治療可抑制人(rén)源化(huà)小鼠的腫瘤進展，而不會誘導強烈的炎症反應最後，作(zuò)者使用人(rén)源化(huà)小鼠模型測試了(le)YST-OVH的有效性。将Huh-7人(rén)肝癌細胞皮下(xià)植入NSG小鼠中，YST-OVH顯著抑制腫瘤的生(shēng)長，且作(zuò)用優于OVH(圖7B-E)。此外，并沒有觀察到細胞因子(zǐ)升高或體(tǐ)重的顯著變化(huà)(圖7F-H)。總的來(lái)說(shuō)，這(zhè)些(xiē)結果表明，YST-OVH顯著增強了(le)抗腫瘤療效，并可能(néng)在人(rén)源化(huà)小鼠模型中具有良好(hǎo)(hǎo)的耐受性。通過工程化(huà)的YST-OVH 局部遞送 PD-1 抑制劑是一(yī)種高效且安全的癌症免疫治療策略。 YST-OVH 還與 CTLA-4 或 TIM-3 阻斷劑協同作(zuò)用以增強對癌症的免疫反應。 這(zhè)些(xiē)數據為(wèi)進一(yī)步臨床評估這(zhè)種新(xīn)的治療方法提供了(le)強有力的依據。
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