近期研究表明溶瘤病毒（OV）正在成為(wèi)免疫原性細胞死亡（ICD）的有效誘導劑，其在感染癌細胞後可激活固有免疫細胞，引起固有免疫應答(dá)，釋放(fàng)出有效抗癌免疫的内源性分(fēn)子(zǐ)（DAMP），誘導有效的抗癌免疫。溶瘤新(xīn)城疫病毒（NDV）在膠質瘤細胞和肺癌細胞中均能(néng)産生(shēng)ICD。ICD的特征是損傷相關(guān)分(fēn)子(zǐ)模式（DAMP）、OV衍生(shēng)病原體(tǐ)相關(guān)分(fēn)子(zǐ)模式（PAMP）分(fēn)子(zǐ)和炎性細胞因子(zǐ)的分(fēn)泌、釋放(fàng)或表面暴露。
在已完成第一(yī)期/第二期臨床試驗的OVs中，新(xīn)城疫病毒（NDV）是一(yī)種禽副粘病毒，作(zuò)為(wèi)晚期癌症患者的溶瘤劑，已取得不錯療效，此外，溶瘤NDV通過誘導ICD在原位膠質瘤中觸發腫瘤特異性免疫記憶。來(lái)自上(shàng)海的邵曉燕團隊最近報(bào)告了(le)一(yī)株溶瘤NDV菌株FMW（此處為(wèi)NDV/FMW）是肺癌細胞中有效的ICD誘導劑。在本研究中，研究人(rén)員(yuán)的目的是探討(tǎo)NDV／FMW是否誘導黑色素瘤細胞ICD及其調控途徑。作(zuò)者發現(xiàn)，NDV/FMW在培養的黑色素瘤細胞和小鼠模型中都能(néng)觸發ICD，且可以通過靶向信号轉導子(zǐ)和轉錄激活子(zǐ)3（STAT3）來(lái)調節。
為(wèi)了(le)探討(tǎo)NDV／FMW是否能(néng)在黑色素瘤細胞中引發ICD，該研究團隊首先檢測NDV／FMW是否能(néng)在黑色素瘤細胞中複制并引發胞死亡。與作(zuò)者之前在肺癌和甲狀腺癌細胞中的研究結果一(yī)緻，NDV /FMW在人(rén)類黑色素瘤A375和C8161細胞中能(néng)大量複制，表現(xiàn)為(wèi)病毒滴度升高和NDV血凝素神經氨酸酶蛋白（HN）的表達上(shàng)調。鑒于溶瘤NDV在膠質瘤和肺癌細胞中觸發ICD，該團隊假設NDV /FMW會在黑色素瘤細胞中誘導ICD。為(wèi)了(le)驗證這(zhè)一(yī)假設，該團隊測量了(le)病毒感染後上(shàng)清液中的ICD标記物ATP、HMGB1和HSP70/90的含量，并檢查了(le)受感染黑色素瘤細胞的細胞表面CRT表達（外CRT）。選擇米托蒽醌（MTX）治療作(zuò)為(wèi)陽性對照，如(rú)圖1A所示，與模拟感染細胞相比，NDV/FMW感染的A375和C8161細胞的共焦成像顯示，在感染後24和48（hpi），細胞表面CRT（紅(hóng)色）的暴露增加。
正如(rú)預期的那樣，MTX治療在兩種黑色素瘤細胞系中都誘導了(le)CRT的強烈暴露。此外，流式細胞術分(fēn)析進一(yī)步證實了(le)NDV/FMW感染誘導的A375和C8161細胞CRT暴露（圖1B）。為(wèi)了(le)檢測NDV感染的黑色素瘤細胞中的分(fēn)泌性DAMP，收集細胞培養基并在24和48 hpi下(xià)濃縮。ELISA法檢測ATP分(fēn)泌和HMGB1釋放(fàng)，免疫印迹法檢測其他釋放(fàng)的DAMP。如(rú)圖1C、E所示，經ELISA測定，在24小時(shí)或48小時(shí)感染A375和C8161細胞系的NDV/FMW分(fēn)别導緻細胞外ATP和HMGB1的增加。此外，在48 hpi時(shí)，在感染NDV/FMW的A375和C8161細胞系的濃縮上(shàng)清液中檢測到HMGB1和HSP70/90蛋白水平顯著升高（圖1D）。
ICD的發生(shēng)率通常被認為(wèi)與細胞凋亡、自噬、程序性壞死或内質網應激密切相關(guān)。作(zuò)者之前的研究表明，自噬而非凋亡或壞死有助于NDV介導誘導的肺癌細胞ICD。在黑色素瘤細胞中檢測細胞凋亡、自噬、壞死或内質網應激可能(néng)在NDV/FMW觸發的ICD中發揮作(zuò)用，研究人(rén)員(yuán)分(fēn)别用泛半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶抑制劑Z-VAD-FMK（Z-VAD）、自噬抑制劑氯喹（CQ）、壞死抑制劑Necrostain-1（Nec1）和内質網應激抑制劑GSK2606414（GSK）預處理(lǐ)細胞。圖2A顯示，與單獨使用病毒處理(lǐ)的細胞相比，受試的四種抑制劑均有效減緩了(le)暴露于NDV/FMW的A375細胞中HMGB1和HSP70/90的釋放(fàng)。在C8161細胞中獲得了(le)與A375細胞相似的結果（圖2C）。此外，為(wèi)了(le)評估凋亡、自噬、壞死或内質網應激抑制劑對新(xīn)城疫病毒/FMW誘導的細胞死亡的影響，圖2B、D顯示了(le)台盼藍試驗的細胞死亡率（圖2B、D）。
JAK-STAT3信号在抗癌免疫治療和白細胞介素-6（IL-6）介導的腫瘤進展效應等細胞因子(zǐ)中起着關(guān)鍵作(zuò)用。因此，該團隊假設STAT3可能(néng)在黑色素瘤細胞中NDV誘導的ICD中發揮作(zuò)用。為(wèi)了(le)驗證這(zhè)一(yī)點，該團隊首先檢測了(le)黑色素瘤細胞中STAT3（Y705處STAT3的酪氨酸磷酸化(huà)）對NDV/FMW感染的反應。如(rú)圖3A所示，NDV/FMW感染A375和C8161細胞導緻48 hpi時(shí)pSTAT3（Y705）顯著下(xià)降。Mcl-1和Bcl-xl是兩個(gè)已知的STAT3靶基因，在感染細胞中持續下(xià)調（圖3A）。接下(xià)來(lái)，該團隊研究了(le)抑制STAT3對黑色素瘤細胞中NDV／FMW複制和細胞死亡的影響。
為(wèi)了(le)實現(xiàn)這(zhè)一(yī)目标，該團隊在實驗中使用了(le)C188-9，這(zhè)是一(yī)種在晚期癌症早期臨床試驗（NCT03195699）中評估過的特異性STAT3抑制劑，并驗證了(le)其療效通過降低(dī)STAT3的磷酸化(huà)水平。作(zuò)者觀察到，在48 hpi下(xià)，用C188-9預處理(lǐ)明顯拮抗NDV/FMW感染誘導的A375和C8161細胞PARP裂解、p62減少和eIF2α磷酸化(huà)（圖3B）。值得注意的是，C188-9治療降低(dī)了(le)感染黑色素瘤細胞中NDV蛋白HN的蛋白水平（圖3B），表明抑制STAT3可能(néng)會減少黑色素瘤細胞中NDV/FMW的複制。
在證明STAT3的藥理(lǐ)學抑制會影響NDV/FMW介導的黑色素瘤細胞死亡後，作(zuò)者提出抑制STAT3是否會對NDV/FMW誘導的ICD标記物産生(shēng)影響。如(rú)圖4A、B所示，分(fēn)别通過共聚焦成像和流式細胞術測定，用C188-9預處理(lǐ)減少了(le)A375和C8161細胞中NDV/FMW感染引起的CRT暴露。此外，通過免疫印迹和ELISA檢測，暴露于C188-9可減少NDV感染後A375和C8161細胞中HMGB1、HSP70和HSP90的ATP分(fēn)泌和釋放(fàng)（圖4C-E）。有趣的是，IL-6預處理(lǐ)增強了(le)NDV/FMW處理(lǐ)的A375細胞和C8161細胞中HSP90的釋放(fàng)（圖4C）。此外，與單獨的病毒感染相比，C188-9治療降低(dī)了(le)NDV/FMW感染細胞的病毒産量，而IL-6處理(lǐ)提高了(le)A375細胞和C8161細胞的病毒滴度（圖4F）。
為(wèi)了(le)排除C188-9可能(néng)的脫靶效應，研究人(rén)員(yuán)用慢(màn)病毒介導的靶向STAT3的shRNA在A375和C8161細胞中穩定地敲除STAT3。通過免疫印迹試驗證實了(le)敲除的結果（圖5A）。這(zhè)與C188-9對NDV/FMW介導的黑色素瘤細胞死亡的影響一(yī)緻，STAT3缺失也(yě)降低(dī)了(le)NDV/FMW誘導的PARP裂解和eIF2α磷酸化(huà)（圖5B）。值得注意的是，與對照shRNA處理(lǐ)的A375細胞相比，STAT3缺失的A375細胞中ICD标記物的誘導（包括CRT暴露、ATP分(fēn)泌、HMGB1以及NDV感染時(shí)HSP70/90的釋放(fàng)）嚴重減弱（圖5C-F）。這(zhè)在C8161細胞中獲得了(le)類似的結果（圖5C–F）。
該團隊之前的研究表明，NDV感染的肺癌細胞上(shàng)清液在體(tǐ)内抑制腫瘤生(shēng)長。為(wèi)了(le)研究NDV感染的黑色素瘤細胞上(shàng)清液是否能(néng)抑制體(tǐ)内黑色素瘤的生(shēng)長，研究人(rén)員(yuán)收集并濃縮了(le)上(shàng)清液并用紫外線照射以滅活病毒。A375腫瘤模型小鼠瘤内注射NDV /FMW，或濃縮上(shàng)清液或空白對照。如(rú)圖6A所示，與空白對照的腫瘤相比，上(shàng)清液顯著抑制了(le)黑色素瘤的生(shēng)長。正如(rú)預期的那樣，NDV/FMW注射顯著降低(dī)了(le)腫瘤生(shēng)長（圖6A）。此外，與瘤内注射PBS的小鼠相比，瘤内注射濃縮上(shàng)清液明顯延長了(le)A375腫瘤模型小鼠的存活時(shí)間(jiān)（圖6B）。
該團隊的研究表明并證明，溶瘤NDV \ FMV病毒能(néng)刺激黑色素瘤細胞中ICD印記的表達和釋放(fàng)。除此之外，該團隊還驗證了(le)細胞死亡的多樣性，這(zhè)在很大程度上(shàng)進一(yī)步促進了(le)NDV/FMV誘導的ICD标記物的釋放(fàng)。值得注意的是，轉錄因子(zǐ)STAT3在暴露于NDV /FMW的黑色素瘤細胞中誘導ICD中起着關(guān)鍵作(zuò)用。
文章來(lái)源：https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fonc.2019.00436/full